Creșterea capacității de intervenție și răspuns în infecțiile produse de germeni emergenți, re-emergenți și cu rezistență la antimicrobiene ca sprijin pentru clinică și sănătatea publică
Perioadă de desfășurare: 2023-2026
Sursa de finanțare: Proiect finanțat de Ministerul Cercetării, Inovării şi Digitalizării
Responsabil proiect: Dr. Cristiana Cerasella DRAGOMIRESCU
Echipa: Personalul din cadrul laboratoarelor Centrului național de expertiză si intervenție în sănătate publica pentru agenții CBRN
Contractor: Institutul Național de Cercetare-Dezvoltare Medico-Militară „Cantacuzino”
REZULTATE
Scop
Îmbunătățirea capacității curente de diagnostic rapid și eficient, prin identificarea și caracterizarea fondului circulant de agenți infecțioși (virusuri, bacterii, paraziți, fungi) emergenți și re-emergenți dar și detecția factorilor de virulență și a mecanismelor de rezistență la medicamentele antimicrobiene pentru prevenirea și controlul bolilor infecțioase în România și Europa.
Obiectivele proiectului
Obiectiv general.
Prevenirea și controlul infecțiilor cu germeni emergenți și re-emergenți prin caracterizarea de finețe a agenților patogeni, aplicând cele mai noi tehnici de diagnostic fenotipic sau molecular recomandate de autoritățile internaționale pentru detecția factorilor de virulență și a mecanismelor de rezistență dobândite sau intrinseci și pentru tipizarea tulpinilor circulante, analiza comparativă cu tulpini circulante în Europa, inclusiv testarea unor alternative terapeutice ce ar putea fi aplicate în gestionarea unor cazuri de infecții depășite terapeutic datorită rezistenței multiple a germenilor (virusuri, bacterii, fungi).
Obiective specifice.
1. Izolarea și identificarea a cel puțin 100 de tulpini microbiene cu caractere deosebite urmată de secvențierea a cel puțin 40 tulpini reprezentative, în fiecare an al proiectului.
2. Optimizarea tehnicii real-time-PCR pentru detectarea a cel puțin 5 gene de rezistență reprezentative, în cazul a cel puțin 30 de tulpini microbiene cu caractere deosebite, urmată de realizarea unui protocol aplicabil și în alte situații și pentru extinderea studiilor la nivel național.
3. Realizarea a cel puțin unui nou mediu de cultură pentru izolarea și identificarea agenților microbieni rezistenți și multi-rezistenți la antibiotice, în primul an al proiectului, urmat de utilizarea acestui mediu în spitale pilot și direcții de sănătate publică la nivel județean și municipiul București.
4. Punerea la punct în primul an de desfășurare a proiectului a cel puțin unui protocol de supraveghere prin metode de laborator a cel puțin 2 dintre germenii cu potențial de răspândire în condiții de război sau alte calamități, validarea protocolului și utilizarea acestuia la nivel județean și național, prin legătura între direcțiile de sănătate publică, institutul național de sănătate publică și INCDMM „Cantacuzino”.
5. Studierea a cel puțin unei metode de utilitate în medicina personalizată, punerea la punct a protocolului de lucru, validarea metodei prin studii aprofundate, prezentarea rezultatelor la nivel național, publicarea protocolului de lucru și aplicarea rezultatelor pozitive în mod eficient.
6. Publicarea în fiecare an de desfășurare a proiectului a cel puțin 5 articole în reviste medicale cu factor de impact și a cel puțin 10 articole în reviste medicale indexate în baze de date internaționale, precum și prezentarea la congrese sau conferințe naționale și internaționale a minim 12 lucrări în fiecare an de desfășurare al proiectului.
Descriere proiect
În acest proiect ne propunem să izolăm micoorganisme implicate în infecții umane, să le identificăm și să le aplicăm tehnici de caracterizare de mare finețe până la secvențierea întregului genom pentru obținerea informațiilor privind factorii de virulență și rezistența șa antimicrobiene.
Stabilirea cât mai rapid și mai corect a etiologiei unei infecții este esentială pentru o îngrijire medicală eficicientă, indiferent că este vorba despre cazul izolat de boală al unui individ sau despre colectivitate și managementul unei epidemii. Noile tehnologii bazate pe tehnici moleculare și genomice adoptate în abordarea de laborator a bolilor infecțioase conferă rapiditate, sensibilitate și usurință în detecția și cuantificarea patogenilor responsabili de povara medicală asociată lor.
Nevoia unui diagnostic de calitate, care să confere un suport solid efortului clinic nu a fost niciodată mai clar percepută ca în timpul pandemiei de COVID-19. Drept urmare, tendința de deschidere către cele mai performante tehnologii pentru identificarea rapidă și cunoașterea cât mai aprofundată a agenților infecțioși, remarcată pe plan global, s-a concretizat în oportunitatea de a le putea utiliza în practica de zi cu zi. Cu toate acestea, provocările generate de integrarea lor în clinică nu pot fi ignorate, în special in cazul unor limitări financiare și lipsei de personal instruit. Ca urmare, cel mai potrivit este ca evaluarea algoritmului de diagnostic și a performanțelor anumitor protocoale să beneficieze de studii experimentale, care să dea siguranța necesară utilizării lor ulterioare în timp real.
Proiectul crează cadrul pentru obținerea unor modele experimentale potrivite pentru a genera date privind fezabilitatea și aplicabilitatea clinică a metodelor contemporane de analiză a agenților infectioși, bazându-se pe o valoroasă colecție institutională de patogeni umani cu relevanță clinică și epidemiologică și expertiza profesională de referință în domeniul abordat.
Secvențierea de nouă generație a schimbat abordarea microbiologică în laboratoarele din întreaga lume. Rezoluția maximă de analiză a acestei tehnologii a permis îmbunătățirea programelor de supraveghere a bolilor infecțioase și creșterea capacității de discriminare în investigațiile epidemiologice, dar a oferit și posibilitatea unui diagnostic metagenomic. Aplicațiile acestuia din urma, corect desemnate din punct de vedere tehnic "shotgun metagenomics", se adresează detecției patogenilor direct în produsele biologice. Ele pot fi asimilate, formal, categoriei metodelor care nu se bazează pe tradiționala cultivare microbiană, asemenea protocoalelor rapide de detecție de antigene și de acizi nucleici, acestea fiind însă dezvoltate pentru anumiți patogeni ("țintă-specifice"), ceea ce le face nepotrivite pentru situațiile în care nu există o suspiciune etiologică. Abordarea de tip "shot-gun metagenomics" a fost explorată inițial pentru diagnosticul virusologic, dovedindu-se utilă nu numai în detectarea unor virusuri cunoscute, precum virusurile gripale sau norovirusurile (1), ci și pentru descoperirea unor așa-numite "virusuri orfane" și documentarea existenței unui fond de virusuri ("virom") aparent neasociat unei patologii infecțioase (2). În același timp însă, secvențierea de tip shotgun a servit deja explorării unor probe clinice umane pentru detectarea și chiar caracterizarea patogenilor bacterieni fără a-i cultiva (3). Avantajele oferite de tehnologia de secvențiere a întregului genom analizei microbiologice sunt susținute prin datele publice generate prin adoptarea ei în practica unor laboratoare naționale europene, încurajată intens de Centrul European de Supraveghere și Control al Bolilor (European Centre for Disease Prevention and Control, ECDC). Limitarea implementării ei pe scară largă rămâne însă un aspect care nu poate fi ignorat, experiența căpătată până acum dezvăluind nu numai excepționala sa performanță de tipizare dar și dificultățile asociate validării și interpretării volumului masiv de informație pe care-l generează. De altfel, ca orice nouă tehnologie adoptată în microbiologie, integrarea secvențierii de nouă generație în algoritmul de analiză trebuie atent monitorizată, necesitând obligatoriu o etapă preliminară de pilotare, care să confere siguranța experimentală și încredere în interpretarea rezultatelor.
- în ţară: La acest moment, singurul patogen care beneficiază oficial de supraveghere bazată pe secvențierea întregului genom este SARS-CoV-2, România contribuind astfel în mod nemijlocit la efortul internațional de a depăsi pandemia de COVID-19. Studiile sporadice publicate de echipe de cercetatori români dovedesc însă un interes pentru abordarea acestei tehnologii dintr-o nevoie justificată, în general, de lipsa informațiilor coerente despre patogenii umani cu care se confruntă populația autohtonă și, în special, de incapacitatea de a sesiza, în timp real, amploarea a unor evenimente epidemiologice cu răsunet multistatal.
- în străinătate: Într-unul dintre rapoartele sale, ECDC a propus prioritizarea implementării secvențierii întregului genom (whole-genome sequencing, WGS) pe criterii de relevanță clinică și sănătate publică, promovând în mod deosebit această tehnologie ca suport în investigațiile epidemiologice și pentru supraveghere. Ca urmare, în perioada 2013 – 2017, numărul țărilor europene care au introdus supravegherea bazată pe WGS a crescut de la 0 la 20, iar în 2019, conform unui studiu realizat în rândul laboratoarelor naționale din Comunitatea Europeană, toate statele membre își propuneau să aplice pentru cel puțin un patogen. Ca un exemplu grăitor, din noiembrie 2015 și până în iunie 2018, ECDC a facilitat derularea investigațiilor a 41 epidemii asociate cu consumul de alimente contaminate, presupuse a fi multistatale, în cadrul cărora schimbul de date de secvențiere s-a dovedit nu numai necesar dar și deosebit de eficient (European Centre for Disease Prevention and Control. ECDC strategic framework for the integration of molecular and genomic typing into European surveillance and multi-country outbreak investigations – 2019–2021. Stockholm: ECDC; 2019).
Microorganismele rezistente la antibiotice reprezintă o problemă de majoră de sănătate publică în practica medicală. De exemplu, studiile efectuate arată intransigent faptul că infecțiile cauzate de microorganisme rezistente la carbapeneme sunt asociate cu o morbiditate și mortalitate crescută, precum și costuri ridicate ale îngrijirilor de sănătate, îndeosebi datorită întârzierii administrării unei terapii adecvate și a disponibilității limitate a acesteia (4). Rezistența prin producția de carbapenemaze reprezintă o problemă majoră de sănătate publică, control al infecțiilor și medicină clinică. (5)
Carbapenemazele reprezintă enzime ce conduc la inactivarea (prin hidroliză) a carbapenemelor, de cele mai multe ori ducând la imposibilitatea folosirii acestora în practica clinică (6,7). Spre deosebire de alte mecanisme de rezistență la carbapeneme, carbapenemazele sunt frecvent prezente pe elemente genetice mobile, conducând la posibilitatea de propagare în mediu (spitalicesc), afectând alte microorganisme și constituind un rezervor local de rezistență (8,9). Potrivit datelor raportate la nivel european, România este una din țările Uniunii Europene (alături de Italia și Grecia) unde s-a semnalizat prezența unui nivel ridicat al producției de carbapenemaze(6,10). Spre deosebire de aceste țări, în România, cunoștințele legate de această problematică și de măsurile de control al infecțiilor sunt minime. Este de remarcat faptul că România a raportat nivele ridicate de rezistență și față de alte antibiotice considerate de ultimă linie terapeutică cum ar fi colistinul, fosfomicina sau tigeciclina (70,5%, 100% respectiv 18%)(6).
Din ce în ce mai acut, dinamica răspândirii rezistență la antibiotice (RAB)a atins un nivel alarmant, determinand eșecuri terapeutice, deoarece patogenii potențial rezistenți limitează numărul măsurilor terapeutice adecvate și, în plus, întârzie deciziile de tratament, care nu mai pot fi luate empiric (11,12). Exemple bine cunoscute care au dus la extinderea rezistenței sunt β-lactamazele cu spectru extins (BLSE) și carbapenemazele (13), iar șase patogeni sunt considerați extrem de critici si clasificați de Societatea de Boli Infecțioase din America prin acronimul ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp.)(14).Pentru a limita răspândirea lor și a mecanismelor de rezistență și pentru a permite accesul pacienților la o medicație eficientă, cât mai multe informații privitoare la RAB trebuie obținute în cel mai scurt timp posibil. Astfel, identificarea patogenilor și a suportului molecular al RAB sunt esențiale pentru stabilirea unei terapiei antibiotice precise și pentru limitarea răspândirii mecanismelor de rezistență (15).
În plus, abordarea virulenței prezintă un interes din ce în ce mai mare. Bacteriile care nu sunt patogeni obligatorii, care pot exista ca și comensali sau în mod liber s-ar putea transforma în agenți patogeni după dobândirea anumitor factori de virulență, care sunt transferați frecvent pe elemente genetice mobile(16).
Scopul general al studiului îl constituie abordarea și implementarea unor tehnici moleculare de tip real-time PCR, secvențiere a întregului genom (Whole Genome Sequencing), spectrometrie de masă MALDI-TOF-MS pentru a obține rapid caracterizarea potențialelor mecanisme de rezistența și /sau virulență cu impact clinic și epidemiologic.
Infecţiile fungice sunt, în prezent, o problema din ce în ce mai frecventă şi mai dificil de gestionat în secţiile de terapie intensivă, fiind grevate de o serie de dificultăţi de diagnostic, de tratament şi de o rată de mortalitate foarte ridicată.
In ultimii ani s-a înregistrat o creştere alarmantă, atât a incidenţei infecţiilor fungice invazive, cât şi a diversităţii agenţilor etiologici, una dintre cauze fiind creşterea numărului de persoane cu imunodepresie, fiind asociate cu o rată crescută a morbidităţii şi mortalităţii.
Candida auris este un fung levuric implicat in infecții emergente, caracterizat prin transmisibilitate ridicată, rezistență multipla la medicamente antifungice si capacitatea de a produce biofilme(17). C. auris a fost identificat în mai mult de 35 de țări, fiind documentata răspândirea de la persoană la persoană asociată asistenței medicale (18).
În ciuda faptului că primul izolat de Candida auris a fost raportat în urmă cu mai bine de un deceniu, lipsește încă o strategie globală de identificare disponibilă și există o nevoie urgentă de terapie eficientă împotriva acestui patogen multirezistent la terapeutice antifungice.
Pentru detectarea tulpinilor de C. auris din probele clinice, există mai multe metode fenotipice, însă acestea nu sunt fiabile, având în vedere că speciile C. auris și C. haemulonii sunt strâns înrudite și nu sunt ușor de distins cu fenotipic, astfel ca C. auris a fost identificat sistematic incorect prin metode fenotipice în laboratoarele de microbiologie clinică (19,20). În țări în curs de dezvoltare, datorită lipsei disponibilității tehnologiei de laborator, C. auris este un agent patogen necunoscut în laboratoarele de rutină și majoritatea izolatelor de Candida sunt probabil diagnosticate greșit (21).
Identificarea rapidă și corectă a C. auris este necesară pentru a aplicarea unei terapii adecvate pacientului.
Cultivarea pe CHROMagar Candida a fost descrisă de (22). Mediul nou CHROMagar™ Candida Plus (CHROMagar, Franța) permite o fiabilitate in identificarea prezumtivă a C. auris, ca o nouă culoare specifică - albastru deschis cu un halou albastru - obținându-se astfel o sensibilitate și specificitate de 100% la 36 h de incubație (23). O alta metodă biochimică este identificarea prin API® 20C, deși C. auris poate fi identificat greșit precum Rhodotorula glutinis, Candida sake și Saccharomyces cerevisiae (24).
Sistemul VITEK® 2 este un alt instrument pentru identificarea tulpinilor de C. auris, însă studiile au arătat că VITEK® 2 (versiunea 8.01), sistemul de identificare a levurii are o capacitate limitată de a identifica corect C. auris și performanța generală a acestuia diferă probabil în funcție de clada genetică C. auris
Testele bazate pe sistemul automat precum cel asistat de matrice timpul de zbor de desorbție/ionizare cu laser (MALDI-TOF MS) oferă noi perspective pentru a defini modelul de susceptibilitate al C. auris, prin identificarea speciilor, testarea sensibilității antifungice (AFST). Un studiu realizat de Kwon și colab. sa concentrat pe două sisteme MALDI-TOF MS, inclusiv Biotyper și VITEK® MS, urmate de AFST, secvențierea genei ERG11 și genotiparea. Folosind o bibliotecă de diagnostic in vitro a VITEK® MS, 96,7% din izolate au fost corect identificate. În acest context este evidentă necesitatea identificării fiabile a C. auris prin metode moleculare bazate pe amplificarea prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) și/sau secvențierea PCR a ADN-ului ribozomal (ADNr). Metodele se bazează pe secvențierea regiunii D1-D2 a ADNr-ului 28s sau a regiunii distanțierului transcris intern (ITS) poate identifica, de asemenea, în mod sigur C.auris. O altă opțiune pentru detectarea C. auris este secventierea genei ARNr 18S și analiza filogenetică(25). De asemenea, au fost aplicate cu succes pentru identificarea C. auris, secvențierea locilor genetici și teste PCR/qPCR. Principalele avantaje ale PCR sunt: identificarea genelor care codifică proteinele GPI, costul său scăzut, timpul scurt și specificitate datorită utilizării primerilor specifici speciei pentru C. auris, C. haemulonii, Candida pseudohaemulonii, C. duobushaemulonii, Candida lusitaniae si C. albicans.
Metodele bazate pe secvențierea întregului genom (WGS) sunt folosite din ce în ce mai mult pentru a detecta și caracteriza tipurile filogeografice și dinamica transmisiei pentru acest agent patogen emergent (Lockhart et al., 2017).
Mulți dintre agenții patogeni intestinali cauzatori de boli diareice acute nu sunt de obicei identificați, fiind dificil de izolat în condiții obișnuite. Cultivarea este o metodă standard de identificare a agenților patogeni intestinali de natură bacteriană, întreaga procedură durează aproximativ 5 -7zile, sau chiar mai mult, pentru a obține rezultatele finale, procedura fiind consumatoare de timp și implică tehnici și expertiză de specialitate. Ca urmare, pacienții ar pierde probabil șansa optimă de terapie, iar centrele de control al bolii nu ar putea lua măsuri eficiente rapid. Se impune necesitatea utilizării unor metode rapide pentru diagnosticul agenților patogeni intestinali declanșatori de boală diareică acută, tehnica multiplex PCR utilizată pentru amplificarea și detecția ADN, fiind o tehnică frecvent utilizată.
În ultimii ani, reacția de polimerizare în lanț (multiplex PCR) și real-time PCR, au devenit abordări alternative în diagnosticul microbiologic datorită ușurinței de utilizare, rapidității, reproductibilității, acurateței și accesibilitații. Reacția multiplex de polimerizare în lanț permite amplificarea simultană a mai multor secvențe țintă într-o singură reacție PCR economisind timp și scăzând numărul de reacţii care trebuie efectuate în vederea evaluării prezenței unor agenți patogeni intestinali în diferite produse biologice (materii fecale).
Detecția patogenilor intestinali utilizând multiplex PCR se va realiza utilizând ca secvențe țintă factori de virulență specifici acestor patogeni intestinali astfel pentru Shigella spp. (ipaH, virF), Y. enterocolitica (YST, yadA, inv, lcrF) Campylobacter jejuni și coli (hipO, asp, 16S-R), Salmonella spp. (invA), Aeromonas (ahh1a, aerA, asa1, 16S rRNA), Vibrio spp. (ompW, gyrB, collagenase, vvhA, 16S rRNA).
Infecțiile respiratorii reprezintă o problemă importantă de sănătate publică, în primul rând, contagiozității ridicate datorate modului de transmitere a acestora pe cale aeriană.
Diagnosticul corect al acestor infecții este foarte important și trebuie să se realizeze în cel mai scurt timp posibil, de aceea trebuie să avem la dispoziție metode cât mai eficiente pentru a decela etiologia bacteriană/virală/fungică, mai ales în contextul pandemiei COVID-19.
Optimizarea metodelor clasice de diagnostic, dar și implementarea unor metode moderne au rolul de a reduce impactul infecțiilor respiratorii în cadrul populației, de a interveni cât mai rapid cu mijloace adecvate, dar și de a se aplica un tratament corect care să aibă ca rezultat eliminarea cauzei îmbolnăvirii.
Difteria este o boală infecțioasă gravă, letală (la persoanele susceptibile) și poate fi prevenită prin vaccinare, în situația unei acoperiri vaccinale de minimum 95% la vârsta de 1 an și de 90% la adult. Este o boală re-emergentă, fapt demonstrat de epidemia de difterie care a cuprins în anii 1990 și începutul anilor 2000, toate țările Comunității Statelor Independente – foste URSS (peste 150.000 cazuri și peste 5.000 de morți, raportate în Regiunea Europeană a OMS).
În Europa, în perioada 2000-2013 s-au înregistrat 967 cazuri de difterie confirmate clinic şi microbiologic, peste 90% dintre acestea fiind în Letonia. Aceste date au fost obţinute din 25 de ţări participante la Proiectul European de Supraveghere a Difteriei DIPNET (Diphtheria Surveillance Network) din care și România a făcut parte. Conform unei informări publicate în 17/11/2015 de Centrul Național de Prevenire și Control din Letonia, din 2002 în această țară au fost înregistrate 20 de decese prin difterie, 4 dintre acestea la copii. Toate aceste persoane erau nevaccinate.
În ultimii ani, numărul de cazuri a variat de la 32 cazuri în anul 2013, 38 cazuri în 2014, 65 în 2015, 49 în 2016, 39 în 2017 și 63 în 2018, iar in 2022, ECDC a lansat o atenționare datorită faptului că în primele 10 luni s-au înregistrat 92 de cazuri la migranți în 7 țări europene. În ultimii ani, în ţări precum Franţa, Germania, Italia, Olanda, Suedia şi Marea Britanie, infecţiile determinate de C. ulcerans au fost mai frecvente decât cele produse de C. diphtheriae. Aceste infecţii au fost transmise frecvent de la animalele de companie, putând prezenta simptomele difteriei respiratorii clasice şi au determinat chiar cazuri fatale. Două rapoarte publicate în anul 2014 fac referire la cazuri de difterie cutanată, determinată de C. diphtheriae, în Austria şi Norvegia la persoane care se întorseseră recent din ţările lor de origine africane. În 2015 în Spania s-a înregistrat primul caz de difterie diagnosticat după 28 ani, soldat cu deces la un copil de 6 ani, nevaccinat, ca urmare a refuzului părinților.
În România, difteria a fost menținută sub control datorită funcționării unui Program Național de Supraveghere. Nu au fost semnalate cazuri de difterie din 1989, în ciuda epidemiei care a afectat țările limitrofe, Republica Moldova și Ucraina. Ultimele tulpini de C. diphtheriae toxigen s-au izolat în 2002. S-a înregistrat și o reducere a numărului de tulpini C. diphtheriae netoxigene izolate în teritoriu (356 tulpini în 1995; 40 în 2007, una în 2022). Datele menționate ar putea să conducă la concluzia că pe teritoriul României au fost create condițiile pentru eliminarea difteriei indigene.
Dar, în contextul migrației populației din Ucraina, ar trebui intensificat interesul pentru supraveghere, în condițiile în care țările europene s-au confruntat cu cazuri nou apărute și la migranți și la persoanele care lucrau în adăposturile de migranți și în condițiile în care în țara noastră, acoperirea vaccinală este sub ținta de 95% la copiii sub 18 luni și nu există vaccinare la adulții de peste 24 de ani conform recomandărilor în vigoare.
O altă boală prevenibilă prin vaccinare care evoluează în cazuri sporadice sau în mici epidemii, este tusea convulsivă. Boală infecțioasă determinată de Bordetella pertussis sau B. parapertussis, care se transmite aerogen și care prezintă un mare potențial de contagiozitate. Diagnosticul de elecție este cel bacteriologic, clasic, cultură cu izolarea bacteriei și identificarea acesteia, dar acest lucru este laborios și foarte rar posibil. O șansă mare de diagnostic este aplicarea unei reacții de tip RT PCR direct din produsul patologic și care ar crește foarte mult rata diagnosticului pozitiv la persoanele cu simptome caracteristice.
În ceea ce privește difteria și tusea convulsivă, ne propunem în cadrul proiectului să ințiem un studiu de supraveghere cu laboratorul prin screening în populația țintă privind portajul de tulpini ce pot prezenta potențial toxigen (Corynebacterium diphtheriae, C. ulcerans și C. pseudotuberculosis) și un diagnostic clasic microbiologic pentru izolarea tulpinilor de B. pertussis și/sau parapertussis completat cu un studiu de seroprevalență pentru a evalua acoperirea vaccinală și nivelul de protecție în populația considerată la risc. De asemenea este de interes optimizarea unor metode de diagnostic rapid bazate pe reacții de tip real-time PCR direct din produsul patologic pentru a scurta la un minim posibil timpul de răspuns terapeutic în caz de boală.
Virusurile respiratorii de tip ARN prezintă o rată crescută a mutaţiilor, conțin informația genetică necesară replicării acestora (suportul infecțiozității virusurilor). Modificările minore ("antigenic drift"), reprezentate de mutaţii punctiforme, produse sub presiunea sistemului imun al gazdei, sunt cauzate de multiplele pasaje ale virusurilor respiratorii de la o gazdă la alta în cursul epidemiilor; aceste mutaţii sunt lent-progresive şi cumulative. Modificările majore (“antigenic shift”) sunt rezultatul recombinării genice între diferite subtipuri virale (de exp. reasortările subtipurilor virale umane şi animale).
Infecțiile virale cu manifestări endemo-epidemice generează o povară considerabilă asupra serviciilor medicale din România ducând la sute de decese, în special în rândul persoanelor cu comorbidități, dar nu numai.
”Testarea” este un instrument extrem de util în controlul unei pandemii determinate de virusuri respiratorii deoarece permite identificarea persoanelor potențial infectate și limitarea răspândirii virusului precum și a efectelor grave ale infecțiilor determinate de acesta. Scopul studiului îl reprezintă determinarea strategiei pentru utilizarea optimă a testării în vederea obținerii informațiilor referitoare la modul de transmitere al virusului în comunitate pentru ”supravegherea” infecțiilor virale printr-un diagnostic etiologic specific și modern în vederea armonizări metodologiei de lucru la nivel european. Proiectul își peopune:
- creșterea capacității de supraveghere a infecțiilor respiratorii prin utilizarea tehnicilor de biologie moleculară și determinări serologice pentru anticorpii specifici produși de organismului uman;
- monitorizarea patogenicității tulpinilor virale identificate în diferite regiuni geografice în relație cu exprimarea fenotipică și testarea sensibilității la antivirale;
- dezvoltarea capacității logistice și de resurse umane pentru obținerea, stocarea și interpretarea datelor în vederea monitorizării în timp real și luarea măsurilor adecvate de răspuns și control la nivel local; integrarea rezultatelor obținute în rețelele de supraveghere europene (The European Surveillance System – TESSy, ECDC) și în bazele de date de la nivel mondial (GISAID, MeaNS, RubeNS, WHO) pentru analiza evoluției genetice a virusurilor respiratorii la nivel global.
- Genul Flavivirus (familia Flaviviridae) include, printre cei peste 70 de membri ai săi, unele dintre cele mai patogene arbovirusuri pentru oameni. Ȋn ultimii douăzeci de ani numărul izbucnirilor epidemice cauzate de flavivirusuri emergente şi intensitatea acestora la nivel european s-au intensificat îngrijorator. Dintre toate flavivirusurile patogene circulante la nivel mondial, se disting trei arbovirusuri a căror emergenţă ȋn Europa se află ȋn atenţia specialiștilor ȋn sănătatea publică. Acestea sunt: virusul West Nile, Virusul Usutu și virusul Denga (cu cele patru serotipuri). Organizaţia Mondială a Sănătăţii consideră că Europa se situează de asemenea expusă la un nivel moderat de risc epidemic cu virus Zika.
Virusul West Nile este un arbovirus zoonotic a cărui circulație naturală este menținută predominant în cicluri enzootice realizate între păsări şi țânțarii ornitofili, mamiferele reprezentând gazde tangențiale. Incepând cu a doua jumătate a sezonului cald, virusul West Nile cauzează infecții umane determinând epidemii repetate, unele de o severitate deosebită. Deşi în general, infecţia cu virus West Nile la om este asimptomatică sau prezintă o simptomatologie uşoară cu manifestări asemănătoare gripei, în unele cazuri (aprox. 1%) se manifestă ca o infecţei gravă neuroinvazivă (meningo-encefalită virală) ce produce adesea sechele neurologice, iar in segmentul de populație vȃrstnicǎ, pe fondul unor boli cronice asociate, cauzează adesea decese. Numai ȋn ultimii cinci ani, Europa a ȋnregistrat 3.513 cazuri umane de infecţii cu virus West Nile, ȋn România fiind semnalate 403 cazuri ce au provocat 59 de decese.
Virusul Usutu a atras recent atenția comunității științifice datorită răspândirii sale extinse în Europa. Virusul s-a răspândit pe o mare parte a continentului european de-a lungul ultimelor două decenii, ducând în principal la mortalități aviare substanțiale, cu o recrudescență semnificativă a infecțiilor păsărilor înregistrate în toată Europa în ultimii câțiva ani. Infecția cu virus Usutu la om este considerată cel mai adesea asimptomatică sau provoacă semne clinice ușoare. Cu toate acestea, au fost raportate cazuri de complicații neurologice, cum ar fi encefalita sau meningoencefalita. Până în 2015, infecția cu virus Usutu a fost raportată de la țânțari, păsări sau cai în 12 țări europene (Germania, Austria, Belgia, Croația, Spania, Franța, Grecia, Ungaria, Italia, Republica Cehă, Serbia și Elveția). În 2018, acest virus s-a răspândit rapid în Europa de Vest, asociat și cu o epidemie mare de infecţii cu virus West Nile. Aceste date sugerează o răspândire geografică continuă a virusului, endemicitatea acestuia în diferite țări europene, așa cum este evaluată prin rapoarte de transmitere repetate în fiecare vară și toamnă, putând fi explicată prin transmiterea enzootică reziduală în zonele afectate, dar fără o expresie clinică detectabilă. Virusul Usutu și virusul West Nile (WNV) au multe caracteristici comune, cum ar fi o strânsă legătură filogenetică și o ecologie similară, cu co-circulația observată frecvent în natură. Cu toate acestea, virusul Usutu a fost mult mai puțin studiat și comparațiile aprofundate ale biologiei acestor viruși sunt încă rare. Ȋn ţara noastră, probabilitatea circulaţiei acestui virus este foarte mare, dar momentan nu a fost evidenţiată din cauza absenţei studiilor.
Virusul Denga este agentul cauzal al bolii cu același nume. Conform Centrului European de Control al Bolilor (ECDC), Denga este o boală virală transmisă de țânțari, răspândită pe scară largă în regiunile tropicale și subtropicale. Boala poate evolua către forme severe, inclusiv febră hemoragică și șoc cu mortalitate ridicată.Este de departe cea mai importantă boală virală transmisă de țânțari care afectează oamenii din întreaga lume; zeci de milioane de cazuri apar în fiecare an, ducând la aproximativ 20.000-25.000 de decese, în principal la copii. Ȋntre 2016 și 2020 au fost ȋnregistrate la nivel european 13.465 de cazuri de Denga majoritatea fiind cazuri de import. Ȋn aceeși perioadă România a ȋnregistrat 37 de cazuri. Vectorii principali ai acestui virus ȋn Europa sunt speciile de ţânţari Aedes aegipty și Aedes albopictus, cel din urmă fiind semnalat pentru prima dată de către noi ȋn România ȋn anul 2012. De atunci, distribuţia sa la nivel naţional s-a extins foarte mult, iar densitatea populaţiilor sale atinge ȋn prezent valori foarte mari. Acest lucru reprezintă un real pericol pentru sănătatea publică existând riscul ca virusul Denga provenit de la cazuri de import să fie preluat de populaţiile locale de Aedes albopictus, fapt ce constituie premiza unor epidemii cu transmitere autohtonă.
Ȋn contextul circulaţiei permanente a virusurilor West Nile, Usutu și Denga precum și a existenţei unui risc de emergenţă a virusului Zika la nivel europen, România trebuie să prevină şi să controleze apariția de noi emergențe arbovirale cauzate de flavivirusuri pentru a putea evita crize majore, sociale şi economice.
Deși diagnosticul precoce al prezenţei acestor flavivirusuri ȋn vederea avertizarilor ȋn timp real va fi posibil doar pentru zona București, screeningul prezenţei acestora se va face ȋn mai multe orașe mari din ţară. Sperăm astfel, să actualizăm stadiul cunoașterii circulaţiei flavivirusurilor ȋn România.
Produsul final al acestui proiect va fi un serviciu ȋn domeniul sănătăţii publice care va anticipa riscul de epidemii emergente cauzate de flavivirusuri.
Ȋn precedentul proiect nucleu, am reușit dezvoltarea și implementarea unui sistem de avertizare ȋn timp real asupra riscului epidemiologic de infecţii cu virus West Nile pentru zona București. Datorită acestui lucru am reușit să identificăm timpuriu zonele anuale de circulaţie activă a acestui virus, să delimităm cartografic și să clasificăm aceste zone ȋn funcţie de gradul de risc estimat și să transmitem avertizări timpurii despre aceste zone către Institutul de Sănătate Publică și Primăria Municipiului București ȋn vederea adoptării urgente de măsuri menite să atenueze riscul de infectări ȋn rândul populaţiei rezidente.
Enterovirusurile, virusuri ARN de polaritate pozitivă aparțin Fam Picornaviridae. Tropismul tisular și capacitatea citolitică a enterovirusurilor sunt responsabile de manifestările clinice. Perioada de incubație a bolii variază între trei și cinci zile. Perioada de transmisibilitate are loc în primele două săptămâni de infecție. Locurile inițiale de replicare a virusului includ organele limfoide ale orofaringelui și ileonul terminal. Mai multe infecții cu enterovirus sunt asimptomatice și sunt limitate în acest stadiu Apare o viremie minoră tranzitorie și virusul se răspândește hematogen în țesutul limfoid în întregul corp. Replicarea virusului la aceste locuri produce o viremie majoră, care coincide cu apariția simptomelor și virusul se răspândește la organele țintă, cum ar fi sistemul nervos central, inima, pancreasul, mușchii sau pielea. Virusul este eliminat din căile respiratorii superioare timp de una până la trei săptămâni și din fecale timp de trei până la opt săptămâni, după replicarea virală în orofaringe și intestin și în timpul reinfectării, virusul este eliminat în scaun timp de 3 săptămâni.
Studiul actual are ca scop evaluarea efectului antiviral al uleiurilor esentiale (UE) de oregano, scortisoara și eucalipt. cu potentiale aplicatii în terapie. Uleiurile esentiale (UE) derivate din plante sunt amestecuri de diferiți compuși lipofili, cu moleculă scăzută, aromatici, volatile (26-29). Numeroase studii in vitro și in vivo au arătat că UE prezintă proprietăți biologice diferite, antimicrobiene, antioxidante (30, 31) efecte imunomodulatoare (32), antiinflamatoare (33) și efecte de vindecare a plăgilor (34). Datorită solubilității în grăsimi, greutății moleculare scăzute și dimensiunilor mici, UE sunt capabile să treacă prin piele, mucoase și membrane celulare și astfel să intre în circulația sistemică a corpului (34).
Infecțiile recurente de tract urinar reprezintă astăzi o importantă cauză de morbiditate, atât din cauza manevrelor exploratorii sau terapeutice invazive utilizate pe scară din ce în ce mai largă cât și din cauza eșecului terapiei cu antibiotice în infecțiile acute, urmată de multe ori de selecția unor tulpini multiplu sau pan rezistente, cu răspândire nosocomială.
Deși se cunoaște rolul preventiv al vaccinurilor, acestea au început să fie utilizate și pentru tratarea unor pacienți cu infecții cronice, recurente, încă din primii ani ai secolului XX. Este vorba de vaccinuri preparate din culturi bacteriene obținute de la respectivii pacienți, așa numitele autovaccinuri sau vaccinuri autogene sau autologe.
În literatură există comunicări ale rezultatelor acestor aplicații care au înregistrat apogeul în jurul anilor 1930, acestea intrând ulterior într-un con de umbră, o dată cu descoperirea și utilizarea a numeroase clase de antibiotice. Utilizarea autovacinurilor a continuat însă pe scară redusă în unele țări din zona est europeană, inclusiv în România, una din principalele recomandări fiind infecțiile urinare recurente.
Folosirea antibioticelor pe scară extinsă, de multe ori incorectă, a condus la apariția fenomenelor de rezistență multiplă și tendința este de creștere a numărului de infecții cu astfel de tulpini, multe cu caracter nosocomial. Unele studii estimează că, în anul 2050, aceasta va fi principala cauză de mortalitate la nivel global.
În condițiile în care ritmul de descoperire și de punere pe piață a unor noi molecule cu rol antibiotic nu face față în prezent ritmului accelerat al apariției infecțiilor cu tulpini multi- sau pan-rezistente la antibiotice, se încearcă găsirea unor noi mijloace terapeutice eficace mai ales pentru aceste cazuri. Revin astfel în atenție vaccinurile autogene.
Unul din factorii care limitează în prezent utilizarea lor pe scară largă (dincolo de costurile de producție și control cu respectarea regulilor de bună practică de fabricație) este lipsa unor evidențe științifice privind pe de o parte eficacitatea (fiind recunoscută variabilitatea acesteia, din cauze încă necunoscute) și pe de alta lipsa unor indicatori clari sau biomarkeri cu rol predictiv pentru evoluția pacienților care urmează un tratament personalizat cu vaccinuri autogene.
Identificarea unor astfel de markeri biochimici, imunologici, hematologici sau bacteriologici ar permite o mai bună selecție a pacienților care ar putea să aibă un real beneficiu după o astfel de opțiune terapeutică și, totodată, s-ar realiza o monitorizare mai obiectivă a acestora atât pe durata tratamentului cât și ulterior. Putem astfel sesiza cât mai precoce apariția unor efecte adverse și nevoia eventuală a repetării curei de tratament.
Cercetările ultimilor ani demonstrează potențialul terapeutic al fagilor și al proteinelor litice, având o gamă considerabilă de aplicații în domeniile medicinii umane și veterinare moderne. Acestea includ utilizarea fagilor întregi virulenți ca agenți antibacterieni, progresele recente în dezvoltarea și aplicațiile fagilor modificați genetic, utilizarea fagilor ca vehicule de eliberare și vaccinuri și evoluțiile recente în studiul și utilizarea endolizinelor purificate reprezintă doar câteva dintre aceste aplicaţii. Prevalența în creştere a microorganismelor relevante din punct de vedere clinic, cu rezistență la multiple clase de antimicrobiene, a dus la intensificarea cercetărilor privind potenţialul utilizării fagilor ca agenţi antimicrobieni. Caracteristicile fagilor: agenți terapeutici ieftini, naturali, disponibili, siguri și eficienți, recomandă folosirea şi reintroducerea terapiei fagice ca o alternativă sau complementar tratamentului cu antibiotice. Bacteriofagii sunt virusuri adaptate parazitării celulei bacteriene. Efectele fagilor asupra bacteriilor sunt de tip litic sau de tip lizogen. Efectul litic are ca rezultat liza bacteriei dupa sinteza în interiorul ei a multor copii ale bacteriofagului, în timp ce efectul lizogen se traduce prin înglobarea acidului nucleic al fagului în ADN-ul bacteriei și imprimarea acesteia a genelor pe care bacteriofagul le deține. Efectul litic al fagului asupra bacteriei este folosit în microbiologie ca test fenotipic de tipizare a tulpinilor bacteriene (lizotipie), ceea ce furnizează date privind filiația cazurilor de îmbolnăvire cu același tip de bacterie în focar, epidemie, respectiv pandemie. Același efect litic poate fi utilizat în terapie personalizată cu suspensii fagice în infecții diverse produse de către bacterii în general multirezistente la antibiotice. Se vorbeste din ce în ce mai frecvent despre faptul că omenirea de găsește în „era pre-antibiotice”, datorită faptului că în ultimii ani nu s-au mai descopert antibiotice noi și bacteriile și-au dezvoltat multiple mecanisme de apărare împotriva antibioticelor folosite în terapie. Așadar, se caută soluții terapeutice alternative, eficiente împotriva infecțiilor bacteriene cu germeni multirezistenți la antibiotice. Una dintre acestea, ar putea fi, terapia cu bacteriofagi, având în vedere că evoluția timp de sute de ani a bacteriilor și fagilor a făcut ca aceștia să iși mențină efectul litic asupra gazdei bacteriene, fără prea mare rezistență a bacteriei.
Situaţia actuală: Utilizarea bacteriofagilor pentru tratarea infecțiilor bacteriene, are o istorie substanțial mai lungă decât cea a antibioticelor fiind folosiţi în tratamentul infecțiilor bacteriene cu aproape un deceniu înainte de descoperirea penicilinei. Este menţionată astfel folosirea în 1919 ca tratament împotriva unor agenți patogeni cum ar fi Shigella dysenteriae (35). Astăzi, se cunosc mult mai multe despre bacteriofagi decât în anii 1930, când terapia cu fagi a apărut pentru prima dată și a început să se răspândească în multe țări. Fagii au co-evoluat impreuna cu gazdele lor de-a lungul anilor și au dobândit mecanisme pentru a contracara mecanismele de apărare a bacteriilor, cum ar fi, de exemplu, producția de biofilm extracelular, ceea ce reduce drastic eficacitatea antibioticelor convenționale. Studiile recente efectuate pe animale și pe om arată că fagii sunt agenți siguri, bine tolerați şi reprezintă o alternativă la agenții chimici (35). Odată cu apariția antibioticelor, bacteriofagii au fost utilizași mai puțin în țările occidentale, dar având în vedere apariția și răspândirea tulpinilor multirezistente la antibioticele uzuale, oamenii de știință iși îndreaptă atenția spre terapii alternative antibioticelor. Rezistența la antibiotice, raportată peste tot în lume, inclusiv în Europa, reprezintă o amenințare gravă la adresa sănătății publice și a siguranței pacienților pentru că determină escaladarea costurilor cu asistența medicală, esec terapeutic și deces.
Pe baza experienței recente și a rezultatelor actuale ale aplicațiilor bacteriofagilor în terapia împotriva infecțiilor bacteriene în țările în care această terapie alternativă este aprobată, mulți oameni de știință și companiile mari au ajuns să creadă că utilizarea fagilor pentru tratarea și prevenirea bolilor bacteriene va avea succes.
În România, bazele studiului bacteriofagilor au fost puse de profesorul Mihai Ciucă. Acesta si-a început studiile în 1920 împreună cu profesorul Jules Bordet la Institutul Pasteur din Bruxelles, cei doi descriind lizogenizarea în anul 1921 (36). La întoarcerea în țară, în 1949, profesorul Ciucă a înființat grupul de cercetare și Școala românească pentru studiul și aplicarea bacteriofagilor în medicină. Rezultatele cercetărilor au fost prezentate la simpozioane și publicate în reviste din țară și din străinătate (36). Între anii 1960 și 1975, cercetătorii români din Institutul „Cantacuzino“ publică mai multe lucrări despre bacteriofagi. Institutul avea în acea perioadă o colecție importantă de bacteriofagi, cu acțiune litică asupra principalelor bacterii responsabile de infecții respiratorii, digestive și urinare. Spre exemplu, în perioada 1955-2002, la Institutul „Cantacuzino“, s-a produs bacteriofagul anticolibacilar utilizat în tratarea infecțiilor urinare (36). Majoritatea articolelor din acea perioadă au descris studii prin care enterobacteriile sau stafilococii rezistenți la antibiotice manifestă o scădere a rezistenței la antibiotice după contactul in vitro cu bacteriofagii (37). Există și studii care arată o rată de sterilizare de 100% a purtătorilor de bacili dizenterici după administrarea de terapie combinată: antibiotic – bacteriofagi (38). Au fost tratate și infecții urinare cu bacterii rezistente la antibiotice cu combinația antibioticbacteriofagi-autovaccin, procentul de sterilizare fiind de aproximativ 90% (39). În cadrul Laboratoarelor Naționale de Referință (Infecții Nosocomiale și Rezistență la Antibiotice, Infecții Enterice Bacteriene și Infecții Respiratorii Bacteriene) există truse de suspensii fagice ce au fost utilizate cu succes timp de zeci de ani pentru lizotipie, test fenotipic ce permite stabilirea filiației cazurilor prin aprecierea gradului de înrudire a tulpinilor izolate din infecții produse de aceeași specie bacteriană. Astfel, există truse de bacteriofagi dedicați tulpinilor de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp., Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Corynebacterium diphtheriae. Aceste truse conțin între 11 și 100 de tipuri diferite de bacteriofagi ce au efect litic asupra tulpinilor din specia respectivă. În ultimii ani, datorită introducerii tehnicilor de tipizare moleculară mult mai fiabile, precise şi reproductibile, lizotipia a pierdut teren și astfel s-a diminuat interesul pentru menținerea viabilității și a concentrațiilor optime pentru suspensiile fagice din colecția Laboratoarelor Naționale de Referință.
În străinătate: apariția bacteriilor rezistente la majoritatea agenților antimicrobieni disponibili în prezent, a devenit o problemă majoră de sănătate publică în întreaga lume, plasându-ne astfel în era "preantibiotice". Preocuparea privind dezvoltarea modalităților alternative de luptă împotriva infecțiilor a devenit una dintre cele mai mari priorități ale medicinei moderne și biotehnologiei. Înainte de descoperirea și utilizarea pe scară largă a antibioticelor, s-a sugerat că infecțiile bacteriene pot fi prevenite și/sau tratate prin administrarea bacteriofagilor. Bacteriologul britanic Ernest Hankin, a raportat în 1896 (40) a descoperiit prezența activității antibacteriene marcate împotriva Vibrio cholerae, pe care a observat-o în apa râurilor Ganges și Jumna din India și a sugerat că o substanță neidentificată este responsabilă de producerea acestui fenomen și de limitarea răspândirii epidemiilor de holeră. Doi ani mai tarziu, bacteriologul rus Gamaleya a observat fenomene asemănătoare în timp ce lucra cu specia Bacillus subtilis (41), iar observațiile altor cativa cercetători sunt, de asemenea, considerate a fi legate de fenomenul actiunii litice a bacteriofagilor (42). Cu toate acestea, niciunul dintre acești cercetatori nu a explorat în continuare rezultatele până când Frederick Twort, un bacteriolog instruit medical din Anglia, a reintrodus subiectul la aproape 20 de ani după observația lui Hankin, raportând un fenomen similar și avansând ipoteza că s-ar fi datorat, printre alte posibilități, unui virus (43). Cu toate acestea, din diferite motive, inclusiv din ratiuni financiare (43, 44), Twort nu a urmărit acest lucru, iar după alți 2 ani efectul bactericid au fost "oficial" descoperit de Felix d'Herelle, microbiolog francez-canadian care lucra la Institutul Pasteur din Paris.
Descoperirea sau redescoperirea bacteriofagilor de către d'Herelle este asociată cu izbucnirea unei epidemii de dizenterie hemoragică severă în rândul trupelor franceze staționate la Maisons Laffitte (la periferia Parisului) în iulie-august 1915. d'Herelle se pare că a observat fenomenul încă din 1910 în timp ce studia mijloacele microbiologice de control al unei epizootii de lăcuste în Mexic. Laboratorul comercial D'Herelle din Paris a produs cel puțin 5 preparate de fagi împotriva diferitelor infecții bacteriene (44). Fagii terapeutici au fost deasemenea produși în Statele Unite, în anii 1940, compania Eli Lilly (Indianapolis, Ind.) a produs șapte produse pe baza de fagi pentru uz uman, împotriva stafilococilor, streptococilor, Escherichia coli și a altor agenți patogeni bacterieni (35). Mai multe instituții din țări din Europa de Est au fost implicate activ în cercetarea și producția de preparate fagice terapeutice, printre care, Institutul Eliava al Academiei de Științe a Georgiei din Tbilisi, Georgia și Institutul de Imunologie și Terapii Experimentale Hirszfeld al Academiei Poloneze de Științe, Wroclaw, Polonia. Institutul din Georgia a devenit una dintre cele mai mari instalații din lume implicate în dezvoltarea preparatelor de fagi terapeutici. În cea mai bună perioada, Institutul a angajat aproximativ 1.200 de cercetatori si a produs preparate de fagi (adesea câteva tone pe zi) împotriva multor patogeni bacterieni, inclusiv stafilococi, Pseudomonas, Proteus, și alți patogeni enterici. Suspensiile fagice au fost utilizate pentru a trata diferite infecții, inclusiv abcese, răni supurative, infecții pelviene, infecții acute și cronice ale tractului respirator superior și infecții ale mastoidei. Cu toate acestea, eficacitatea preparatelor fagice a fost controversată (45), iar odată cu apariția antibioticelor, producția comercială de fagi terapeutici a încetat în cea mai mare parte a lumii occidentale. Din punct de vedere clinic, fagii par a fi inofensivi. Pe parcursul lungii istorii de utilizare a fagilor ca agenți terapeutici în Europa de Est și în fosta Uniune Sovietică (și, înainte de epoca antibioticului, în Statele Unite), fagii au fost administrați oral, în suspensii lichide, în aplicații topic locale (piele, ochi, ureche, mucoasa nazală etc.), prin tamponare, spălături și creme, sub formă de aerosoli sau injecții intrapleurale și intravenos și nu au existat, practic, rapoarte privind complicațiile grave asociate utilizării acestora. Acestea sunt tot atâtea argumente pentru a ne orienta atenția asupra revitalizării suspensiilor fagice și pregătirea în vederea posibilității multiplicării acestora în scopul terapiei în infecții superficiale și invazive produse de bacterii multirezistente la antibiotice.
Acest proiect iși propune să evalueze și să completeze trusele de suspensii fagice (pentru tulpinile de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enteritidis, Salmonella tiphymurium, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Corynebacterium diphtheriae) existente în Laboratoarele Naționale de Referință din INCDMM Cantacuzino, conform recomandărilor Health Protection Agency, în vederea inițierii, într-o fază ulterioară, a tehnicilor de producere a unor suspensii fagice ce vor putea fi utilizate în terapie. Pentru aceasta, obiectivele majore ce trebuie îndeplinite în cadrul acestui proiect, pot fi rezumate astfel: • 1. Identificarea tulpinilor de propagare specifice fiecărei suspensii fagice • 2. Verificarea viabilității suspensiilor fagice • 3. Evaluarea concentrației fiecărei suspensii fagice prin titrarea acesteia pe tulpina de propagare specifică • 4. Aplicarea unor metode specifice de concentrare/diluare a suspensiilor fagice • 5. Depistarea unor posibile surse pentru achizitionarea fagilor care nu mai sunt viabili și nu pot fi concentrați, pentru completarea truselor existente • 6. Documentarea privind tehnicile referitoare la producția de suspensii fagice • 7. Dotarea necesară privind producția de suspensii fagice pentru terapia pesonalizată a infecțiilor ce se pretează la acest tip de tratament.
Activitățile necesare pentru îndeplinirea obiectivelor propuse sunt structurate, după cum urmează:
1. Infecții produse de tulpini bacteriene aerobe și anaerobe și fungice multirezistente la terapeutice, izolate din infecții asociate asistenței medicale sau comunitare
a. Evaluarea utilității clinice a tehnologiei de secvențiere de nouă generație;
b. Optimizarea unei reacți de tip real-time PCR pentru identificarea Acinetobacter spp. în probe clinice concomitent cu detectarea genelor de rezistență la carbapeneme blaNDM, blaOXA-23-like, blaOXA-40-like, blaOXA-51-like, blaOXA-58- like;
c. Optimizarea real-time-PCR pentru identificarea blaKPC, blaVIM, blaIMP, blaOXA-48-like la enterobacterii producătoare de carbapenemaze (CPE);
d. Optimizarea si implementarea unui protocol bazat pe secvențierea întregului genom (WGS) pentru monitorizarea și detecția patogenilor rezistenți;
e. Implementarea unui protocol bazat pe spectrometrie de masa MALDI-TOF pentru detectarea carbapenemazelor;
f. Dezvoltarea și optimizarea de produse (prin adaosuri de agenți selectivi) pentru facilitarea izolării de microorganisme rezistente la antibiotice și validarea produselor pe un lot reprezentativ de microorganisme rezistente izolate în România;
g. Efectuarea unui studiu epidemiologic prospectiv, generator de cunoștințe asupra ecologiei microorganismelor rezistente la antibiotice, de interes medical, prin evaluarea a cel puțin 200 de tulpini izolate clinic;
h. Optimizarea si implementarea unui protocol real-time PCR pentru identificarea Candida auris;
i. Optimizarea si implementarea unui protocol bazat pe secvențierea întregului genom (WGS) pentru caracterizarea tipurilor filogeografice și dinamica transmisiei pentru C. auris.
2. În scopul eficientizării diagnosticului microbiologic al infecțiilor produse de bacterii anaerobe, ne propunem lărgirea spectrului de investigații moleculare asupra celor mai frecvenți patogeni bacterieni anaerobi sau microaerofili implicați în procese infecțioase, vizând, în special, următoarele aspecte: identificarea factorilor de virulență, analiza evoluției spectrului de rezistență la antibiotice,
Identificarea celor mai frecvente tipuri sau clone circulante, prin tehnici de tipizare moleculară,
Detecția rapidă a patogenilor anaerobi sau microaerofili direct în proba biologică, prin protocoale in house sau comerciale de Real-Time PCR,
Implemetarea de metode in vitro, precum cele imunologice, moleculare sau bazate pe spectrometria de masă, inalt sensibile în detectarea și identificarea neurotoxinelor clostridiene (de exemplu BoNT) sau a tulpinilor bacteriene producătoare în diverse tipuri de matrice (alimente, sol, probe biologice umane etc.), ca metode suport pentru metodele in vivo considerate Gold Standard în confirmarea contaminărilor sau a suspiciunilor clinice de botulism.
Evaluarea oportunității de implementare a tehnologiei de secvențiere a întregului genom în rutină, ca instrument de caracterizare comparativă a celor mai frecvenți patogeni anaerobi și microaerofili curenți și istorici, ca instument de investigare a focarelor epidemice sau de identificare a clonelor hipervirulente de Clostridioides difficile, de exemplu,
Evaluarea oportunității de utilizare curentă a tehnicilor de secvențiere în studii metagenomice: de exemplu, analiza interacțiilor dintre tulpinile de Clostridioides difficile și microbiomul intestinal al organismului gazdă pentru identificarea factorilor de risc de colonizare sau pentru abordarea unor măsuri terapeutice post-infecție pentru prevenirea recăderilor.
3. În vederea limitării bolilor infecțioase prevenibile prin vaccinare (difterie și tuse convulsivă) ne propunem următoarele activități:
a. Intensificarea studiului de screening privind portajul de tulpini cu potential toxigen din genul Corynebacterium (C. diphtheriae, C. ulcerans și/sau C. pseudotuberculosis) în populația sănătoasă;
b. Optimizarea unui protocol de real time PCR pentru detecția genei tox care codifică pentru sinteza toxinei direct din produs patologic pentru că difteria are potential letal la persoanele susceptibile și salvarea vieții pacientului depinde de rapiditatea diagnosticului și a instituirii terapiei specifice;
c. Aplicarea metodelor moleculare de detecție a factorilor de virulență la tulpinile circulante de Bordetella pertussis;
d. Studiu de seroprevalență pentru determinarea titrurilor de anticorpi protectori antitoxină difterică și antitoxină pertussis la persoane aparținând diverselor grupe de vărstă.
4. Pentru infecții cu poartă de intrare digestivă ne propunem detecția patogenilor intestinali utilizând reacții multiplex PCR, utilizând ca secvențe țintă factori de virulență specifici acestor patogeni astfel pentru Shigella spp. (ipaH, virF), pentru Y. enterocolitica (YST, yadA, inv, lcrF), pentru Campylobacter jejuni și Campylobacter coli (hipO, asp, 16S-R), Salmonella spp. (invA), Aeromonas (ahh1a, aerA, asa1, 16S rRNA), Vibrio spp. (ompW, gyrB, collagenase, vvhA, 16S rRNA).
5. Pentru caracterizarea virusurilor respiratorii se impune:
a. Obținerea secvențelor din fiecare ”lanț de transmitere” în timpul fazei de eliminare/eradicare (de exemplu virusul rujeolei și rubeolei) sau probe reprezentative din fiecare focar în timpul fazei de identificare și control (de exemplu pentru virusurile gripale și non-gripale);
b. Efectuarea cercetãrilor pentru introducerea sau optimizarea metodelor avansate pentru supraveghere a agentilor virali care, fie sunt pe cale de eradicare sau control, fie nu au fost pânã în prezent identificate în România și care pot produce îmbolnãviri severe, sechele, malformatii congenitale.
6. În ceea ce privește virusurile cu transmitere prin vectori, ne propunem să ne extindem capacitatea de diagnostic precoce și avertizare timpurie și la celelalte flavivirusuri cu circulaţie activă ȋn Europa, dar și a celor cu potenţial de emergenţă (cum este cazul virusului Zika).
7. Optimizarea protocoalelor de secvențiere a întregului genom utilizând două platforme de secvențiere deosebit de populare la acest moment, de capacitate medie, care generează secvențe scurte de până la 400 pb: Ion Torrent PGM (Life Techologies) și Illumina MySeq.
a. Validarea experimentelor se va face pe baza parametrilor de calitate aplicați diverselor etape de lucru: extracție de material genomic și preparare biblioteci de ADN (cantitate și calitate ADN), secvențiere (calitatea secvențelor brute apreciată prin scorul de calitate Phred; uniformitatea acoperirii genomice), procesarea datelor de secvențiere (mapare și asamblare evaluată prin număr de secvențe contig, valoare N50, lungime minimă a secvenței contig) și analiza datelor;
b. Aplicarea acestor protocoale de secvențiere a întregului genom pe un număr de minim 150 de tulpini de bacterii, virusuri și fungi de interes cu prelucrarea ulterioară a informațiilor obținute în vederea limitării trasnsmiterii acestor patogeni în mediul de unde au fost izolați
8. În vederea introducerii de noi terapii alternative in tratarea infectiilor produse de enterovirusuri (Coxsackie A si B) ne propunem testarea efectului antiviral al unor uleiuri esențiale extrase din oregano, scorțișoară și eucalipt (în baza unor testări preliminare care permit estimări favorabile în legătură cu acest obiectiv).
9. Tot ca alternativă terapeutică, ne propunem caracterizarea viabilității și a determinării concentrației unor suspensii de bacteriofagi din colecțiile laboratoarelor din Institututul Cantacuzino, ce pot fi pregătiți în viitor pentru a fi utilizați în tratarea unor infecții localizate produse de tulpini bacteriene multirezistente.
10. Identificarea unor biomarkeri predictivi (biochimici, imunologici, hematologici și bacteriologici) pentru evoluția pacienților cu infecții recurente de tract urinar sub tratament personalizat cu vaccin autogen (autovaccin) propunem introducerea în studiu a unui număr de minim 30 de pacienți care vor fi monitorizați pe parcursul derulării proiectului
