Unelte de accesibilitate

Institutul Național de Cercetare-Dezvoltare Medico-Militară „Cantacuzino”

Dezvoltarea de sisteme particulate bazate pe proteine recombinante de interes vaccinal pentru infecțiile respiratorii virale 

Perioadă de desfășurare: 2023-2026  
Sursa de finanțare: Proiect finanțat de Ministerul Cercetării, Inovării şi Digitalizării
Responsabil proiect: CS III, Vlad Tofan (tofan.vlad@cantacuzino.ro)
Echipa: Personalul din cadrul laboratoarele Centrului de Cercetare Dezvoltare Tehnologică.
Contractor:  Institutul Național de Cercetare-Dezvoltare Medico-Militară „Cantacuzino”

REZULTATE
 
Scop
Proiectul își propune implementarea, la nivel de laborator, respectiv la nivel de unitate pilot, a unei abordări „end to end” în ce privește procesul de producție de formule vaccinale inovative pentru creșterea capacității de răspuns rapid la provocările de sănătate publică. O atenție deosebită este îndreptată către realizarea de preparate vaccinale pentru combaterea/protecția împotriva infecțiilor respiratorii virale.
     În acest scop, soluțiile propuse se bazează pe obținerea de antigene proteice prin tehnologia ADN recombinant, având ca platformă de sinteză sisteme procariote (tulpini E. coli), cât și sisteme eucariote (linii celulare de tip HEK293, celule de insecte). Ulterior, proteinele obținute sunt condiționate sub forma unor ansambluri nanoparticulate, fie prin folosirea unor „triggeri” de autoasamblare, fie prin folosirea unor sisteme de adjuvanți de tip „oil-in-water”. Preparatele vaccinale vor fi testate utilizând modele in vitro și in vivo pe linii de șoareci de laborator pentru a evalua potențialul vaccinal din perspectiva capacității de a induce un răspuns imun protector.
     Întregul proces va fi supus unui mecanism de optimizare continuu, care se va adresa fiecărei etape specifice. Optimizările vor viza design-ul secvențelor ADN codificatoare, vectorii folosiți, condițiile de cultură pentru expresie proteică crescută, metodele de purificare și calitatea structurală și variantele de asamblare și adjuvantare a antigenelor. În plus, particularitățile răspunsului imun generat și gradul de protecție în urma imunizării va permite evaluarea  nivelului de fezabilitate pentru producția la scală a preparatelor vaccinale testate.   
     Rezultatele principale preconizate vor fi sub forma unor preparate vaccinale cu eficiență dovedită la nivel de studiu pe model de animal de laborator, a căror producție e fezabilă la nivel de unitate pilot. Ca rezultat secundar, se va dezvolta un „pipeline” bicomponent care va cuprinde producția de antigene cu potențial vaccinal și asamblarea acestora sub formă de nanostructuri cu sau fără adjuvant. Acest livrabil are o valoare potențială intrinsecă mai mare, întrucât permite flexibilitate și reacție rapidă în oferirea de soluții în caz de urgențe medicale la nivel regional. În paralel, se vor obține următoarele rezultate de etapă, de mică anvergură, dar cu potențial de a iniția ramificări în studii conexe: o librărie de vectori plasmidiali conținând secvențe codificatoare optimizate pentru antigene de interes în infecțiile virale respiratorii; o librărie de proteine recombinante cu potențial antigenic, corespunzătoare secvențelor ADN nou create; procedee de sinteză nanostructuri autoasamblabile sau cuplate cu adjuvanți și metode de caracterizare fizică și funcțională; metodologii de optimizare a condițiilor de sinteză proteine în sisteme de expresie procariotă și eucariotă; metodologii de descriere și evaluare a răspunsului imun in vitro și in vivo, inclusiv dezvoltare de metode bazate pe tehnologii qPCR și secvențiere next-gen.

Obiectivele proiectului
Obiectivul principal al proiectului este constituit de dezvoltarea unor nanostructuri proteice cu potențial vaccinal sintetizate prin tehnologie ADN recombinant în scopul combaterii infecțiilor virale respiratorii.
Obiectivele specifice sunt reprezentate de:
 1. construirea unei platforme flexibile de dezvoltare de antigene de interes vaccinal;
 2. realizarea şi optimizarea unor procedee exhaustive de caracterizare a moleculelor proteice şi a nanostructurilor rezultate în urma asamblării cu sau fără adjuvanţi;
3. explorarea in vitro şi in vivo a imunogenităţii candidaţilor vaccinali obţinuţi atât din punct de vedere al răspunsului imun umoral cât şi al celui celular;
4. scalarea la nivel de unitate pilot a antigenului/nelor selectate.
Proiectul, prin obiectivul principal, dar și prin obiectivele specifice, este în strânsă corelație cu obiectivele stabilite în propunerea de Program Nucleu, în principal cu Obiectivul 1: Dezvoltarea unor nanostructuri proteice cu potențial vaccinal.
     Dezvoltarea de vaccinuri este o prioritate la nivel global, pentru multe dintre afecțiunile cauzate de agenții infecțioși, vaccinarea fiind considerată cea mai eficientă soluție. Cel mai adesea, vaccinurile sunt produse folosind tehnologii bazate pe patogeni inactivați sau atenuați, care, anterior, necesită propagare pe culturi celulare sau ouă embrionate. În ultimii ani, în contextul pandemiei cauzate de SARS-Cov2, dezvoltarea de noi tehnologii a luat avânt, cele mai de succes abordări fiind cele care au permis producție rapidă, anume vaccinurile bazate pe ARN mesager. Deși sistemul constituit de ARN mesager și „carrier”-ul lipidic este, cel puțin în teorie, adaptabil la orice secvență de antigen, s-a observat că dezvoltarea unui astfel de vaccin este foarte costisitoare, necesitând optimizări intensive. În acest context, nu este o surpriză că variantele de vaccin eficiente împotriva SARS-Cov2 au necesitat investiții enorme, prohibitive pentru instituțiile de sănătate publică, dar mai accesibile marilor consorții farmaceutice private. În plus, împotriva acestor tip de vaccinuri s-a dezvoltat un val de reticență publică cauzat de asocierea cu măsurile nepopulare care au fost impuse de căre statele afectate de efectele pandemie. Astfel, la nivel global, existența unei capacități de dezvoltare rapidă de vaccinuri pentru uz uman la costuri reduse nu poate fi considerată o noutate, ci, mai curând, o raritate. Cu atât mai mult la nivel național, dar și regional, unde, la momentul actual, față de situația curentă, o astfel de posibilitate ar reprezenta o noutate absolută.
Descriere proiect
      Infecțiile respiratorii virale pot crea dezastre la nivel mondial, așa cum s-a văzut în pandemia COVID-19, cauzată de virusul SARS-CoV-2. Una dintre problemele clinice majore cauzată de infecția cu acest virus respirator este deteriorarea rapidă a stării de sănătate cu evoluție nefavorabilă pentru un subgrup de pacienți. Alte virusuri respiratorii, cum ar fi virusul respirator sincițial (RSV), pot provoca un comportament clinic similar. Multe alte categorii de virusuri printre care virusul gripal pot cauza epidemii asociate cu o rată ridicată de mortalitate și complicații grave.
       Vaccinarea este recunoscută ca fiind una dintre cele mai eficiente măsuri preventive pentru combaterea bolilor infecțioase.
     Vaccinurile SARS-CoV-2 sunt investigate în numeroase studii clinice, cu accent pe obținerea unor titruri ridicate de anticorpi neutralizanți anti-proteina S, pentru a preveni infecția. În prezent, mai multe vaccinuri pe bază de proteina S sau pe domeniul de legare la receptor (RBD) sunt în studii clinice în faze incipiente, inclusiv proteine ​​S trimerice recombinante, domenii RBD monomerice sau trimerice și analogi livrați prin vectori virali sau ARNm. Cu toate acestea, nu este clar care dintre aceste ținte vaccinale are un potențial superior în ceea ce privește imunogenitatea sau capacitatea neutralizantă. Date recente sugerează că vaccinurile pe bază de proteine ​​recombinante ar putea completa vaccinurile pe bază de acizi nucleici sau cu vectori virali. În prezent, mai mult de 10 candidați vaccinali pe bază de proteine recombinante sunt evaluați în studii clinice și peste 50 în studii preclinice în combinație cu diferiți adjuvanți pentru creșterea imunogenicității.
      Virusul sincițial respirator (RSV) este principala cauză de infecții de tract respirator inferior în special la sugari, vârstnici și adulti imunodeprimați. În prezent, nu există un vaccin autorizat pentru prevenirea infectiilor provocate de RSV. Dezvoltarea vaccinurilor anti-RSV a început în 1960, când s-a constatat ca vaccinul pe bază de RSV inactivat cu formol a determinat exacerbarea bolii respiratorii ca urmare a infectiei ulterioare cu RSV datorită  polarizării răspunsului imun spre un răspuns de tip Th2 și a producerii unor anticorpi cu eficacitate scăzută. În prezent există un interes crescut pentru dezvoltarea unor vaccinuri subunitare sigure și cu specificitate crescută. Un interes deosebit este acordat proteinei de fuziune F a cărei administrare în studii clinice s-a dovedit sigură și eficientă. Conformația proteinei F pre-fuziune este preferabilă ca antigen conformatiei post-fuziune datorită inducerii de anticorpi neutralizanți. Deoarece majoritatea proteinelor F din RSV inactivat cu formol au conformație post-fuziune, studiile vizează dezvoltarea de vaccinuri pe bază de proteine recombinante care să adopte conformatie pre-fuziune, împreună cu diferite combinații de adjuvanți, dată fiind imunogenicitatea scăzută a proteinei F.   
    Epidemia de gripă reprezintă anual o amenințare pentru sănătatea publică datorită lipsei vaccinului care să ofere protecție încrucișată împotriva virusurilor gripale noi și emergente. În prezent există o preocupare din ce în ce mai mare pentru dezvoltarea unui vaccin universal, o stategie atractivă fiind  combinarea antigenelor conservate care induc protecție încrucișată mediată de anticorpi cu epitopi care induc protecție încrucișată mediată de limfocite T.
      În ceea ce privește vaccinurile antigripale tradiționale pe bază de ouă embrionate, cu toate că acestea pot proteja împotriva infecției, există eforturi semnificative pentru dezvoltarea de platforme alternative cu scopul de a depăși dezavantajele existente. Dintre aceste dezavantaje sunt de menționat: aprovizionarea cu ouă embrionate care este dificilă în context pandemic, etapele de producție sunt lungi și depind de adaptarea izolatelor umane de virus pentru propagarea pe ouă embrionate. De asemenea, adaptarea virusului gripal pe ouă poate determina substituția unor aminoacizi în structura hemaglutininei (HA) care poate avea drept consecință alterarea sau eliminarea situsurilor antigenice dominante. Producerea virionilor în ouă poate conduce la pattern-uri de glicozilare distincte calitativ și cantitativ de cele exprimate în celulele mamaliene care ar altera imunogenitatea HA sau masca anumite situsuri antigenice asociate efectului protector.
    Ultimii ani au demonstrat că, din punct de vedere al inovației sau al producției de biofarmaceutice, instituțiile publice au dificultăți în a competiționa cu marile corporații farmaceutice. Acest fapt este considerat normal în filozofia de piață liberă și chiar de dorit, dacă considerăm descentralizarea ca un aducător de beneficiu la nivel global. Totuși, în situații de criză de sănătate publică, conform contractului social, datoria de a asigura protecția cetățenilor revine statelor suverane. În contextul declanșării pandemiei cauzate de           SARS-CoV-2, stocurile limitate de vaccinuri și regulile pieții libere au adus majoritatea statelor în imposibilitatea de a putea furniza suficiente doze de vaccin propriilor cetățeni.           Datorită apartenenței la Uniunea Europeană, situația României a fost una favorabilă, beneficiind de doze de vaccin concomitent cu celelalte state membre. În situații viitoare, în funcție de infecțiozitatea patogenului, a gravității simptomelor sau a dificultății de a genera un tratament, există riscul de a nu se putea asigura protecția poplației. Un efort în zona cercetării și dezvoltării de vaccinuri, la nivel național, ar putea aduce beneficii pe termen lung sub formă de siguranță și asigurare a protecției în caz de calamități la adresa sănătății umane.
     Unul din principiile definitorii ale proiectului este „outside the box thinking”. Întrucât nu este realist a se considera că se poate rivaliza cu entitățile private în ce privește tehnologii de dezvoltare de vaccin, proiectul propune căutarea de soluții în zone care nu prezintă foarte multă popularitate la momentul actual. Una dintre aceste zone se referă la vaccinuri bazate pe proteine recombinante, o tehnologie care, deși nu poate fi considerată întru totul neexplorată sau lipsită de admiratori, deocamdată este eclipsată de succesele recente ale vaccinurilor de tip ARN mesager. De asemenea, pentru a explora o zonă și mai puțin populară, proiectul își propune sinteza de proteine recombinante în sistem procariot. Există literatură științifică abundentă care tratează aplicațiile proteinelor sintetizate în E. coli prin tehnologia ADN recombinant, dar dezvoltarea de vaccinuri din proteine recombinante este îndreptată cu predilecție către proteine produse în sisteme de expresie eucariotă, datorită lipsei modificărilor post-translaționale în sistem procariot și a contaminării cu lipolizaharid (LPS).
     Avantajele unei astfel de abordări, în caz de succes, sunt reprezentate de însăși cele două caracteristici necesare în caz de urgență medicală la scală mare: dezvoltare rapidă și număr mare de doze.
     Astfel, similar cu tehnologia ARN mesager, de îndată ce se cunoaște genomul patogenului, se poate sintetitiza în laborator secvența de nucleotide corespunzătoare proteinei de interes. De regulă, sinteza se realizează prin tehnici de sinteză gene, cum ar fi Overlap Extension PCR (OE-PCR), folosind primeri de dimensiuni mari cu capete complementare care acoperă întreaga secvență a genei. Tot în această etapă se poate optimiza secvența nucleotidică folosind cu preponderență codoni specifici sistemului de expresie. După obținerea secvenței codificatoare, aceasta se poate insera prin clonare mediată de restricție enzimatică și ligare într-un vector plasmidial. Plasmidul astfel obținut conține, pe lângă gena de interes, o secvență promoter (ex. T7) în amonte care asigură abundență a transcripției, o secvență care permite selecția pe baza rezistenței la un antibiotic și o origine a replicării pentru multiplicare. Ulterior plasmidul este inserat în bacterii (de regulă, tulpini E. coli) prin transformare bacteriană sau electroporare. Bacteriile sunt apoi crescute în mediu cu antibiotic de selecție și, sub influența unui inductor, declanșează producția de proteină. Ulterior se recoltează masa bacteriană și se poate izola proteina exprimată.
      În cazurile fericite, la nivel de laborator, producția de proteină durează 3 – 5 ore și generează sute de miligrame de proteină de interes per litru. Având în vedere că o doză de vaccin gripal produs prin mijloace tradiționale conține în jur de 15µg, în teorie, se pot genera, prin sinteză în bacterii, echivalentul a peste 10000 de doze pe litru într-un timp foarte scurt, doar într-un singur vas de cultură, cu costuri minime. În scopul îmbunătățirii randamentului, creșterea culturilor bacteriene și capacitatea de sinteză poate fi optimizată. În cadrul proiectului se vor optimiza parametrii de creștere și necesarul de nutrienți, dar se vor folosi și mijloace moderne de predicție a necesarului culturilor prin studii de transcriptomică facilitată de platforme de secvențiere de nouă generație.
     După liza bacteriană, proteina de interes este eliberată în mediu extracelular și poate fi apoi purificată prin mijloace cromatografice, cum ar fi cromatografia de afinitate, de excluziune sterică (SEC) și de schimb ionic (IEX). În plus, impurități de tipul LPS pot fi îndepărtate prin IEX sau cu rășini cu afinitate pentru LPS. În scopul expresiei de proteine cu randament ridicat, dar și pentru a facilita purificarea proteinelor recombinante, în cadrul proiectului, se vor produce și variante proteice fuzionate cu „elastin-like polypeptides” (ELP). Acestea permit expresie abundentă de proteină și permit purificarea direct din lizatele bacteriene prin cicluri de precipitare/resolubilizare, posibile datorită unei tranziții de fază specifice ELP.
     Antigenele purificate sunt în general slab imunogene, de aceea, este foarte importantă alegerea adjuvanților și a sistemelor de livrare a vaccinului care să crească imunogenitatea și să favorizeze un răspuns imun protector. Adjuvanții utilizați, precum și modalitatea de formulare pot influența considerabil calitatea răspunsului imun umoral/celular indus de vaccin, ceea ce poate avea un impact semnificativ asupra eficacității vaccinului. În acest scop, în cadrul proiectului, se vor folosi două sisteme de livrare: nanoparticule autoasamblabile și cuplarea cu adjuvanți nanoparticulați.
     În cazul nanoparticulelor autoasamblabile se va folosi sistemul bazat pe ELP, despre care se știe că la tranziția de faze formează aglomerări mai mult sau mai puțin ordonate, dar cu dimensiuni nanometrice. Se vor folosi și alte abordări de a induce autoasamblarea, cum ar fi cuplarea cu feritină, inducerea de mutații care promovează multimerizare etc. În cazul cuplării cu adjuvant nanoparticulat se vor folosi adjuvanți de tip „oil-in-water” tradiționali sau nou sintetizați sau de tip hidroxid de aluminiu.
      Inițierea răspunsului imun față de un antigen debutează cu activarea diferitelor tipuri de celule implicate în răspunsul imun înnascut dintre care celulele dendritice („dendritic cells”-DC) sunt cele mai eficiente celule prezentatoare de antigen cu rol esențial în inducerea și orientarea răspunsului imun adaptativ. Astfel, dupa captarea antigenului, DC suferă procesul de maturare și migrează în organele limfoide adiacente unde activează limfocitele T CD4+. Diferitele citokine secretate de DC directionează diferentierea limfocitelor T CD4+ în subseturi distincte cum ar fi Th1 si Th2 care, la rândul lor, influențează calitatea răspunsului imun umoral mediat de anticorpii secretați de limfocitele B. În acest context, în cadrul proiectului se va evalua capacitatea candidaților vaccinali de a induce maturarea DC și activarea limfocitelor T într-un model in vitro de cocultură DC-limfocite T. Vor fi selectați candidații vaccinali cu potential imunogen și în urma imunizării animalelor de laborator se va evalua efectul vaccinării asupra polarizării răspunsului imun adaptativ. De asemenea, se vor dezvolta și implementa metode de transcriptomică și epigenomică bazate pe secvențierea de nouă generație pentru a complementa studiile de imunologie.
Faza 1 (2023) – Sinteza constructelor ADN pentru antigenele de interes vaccinal
Obiectiv 1.1 – Selecția proteinelor cu potențial antigenic
Activitate 1.1.1 – Evaluarea din punct de vedere epidemiologic a celor mai frecvenți patogeni virali care cauzează infecții respiratorii
    • Această activitate are ca scop atât identificarea tulpinilor virale circulante cele mai frecvente implicate în patologia respiratorie cât şi a celor emergente
Activitate 1.1.2 – Identificarea celor mai promițători candidați antigenici
    • Se va realiza un studiu de literatură și se vor identifica cele mai potrivite ținte pentru dezvoltarea unor antigene de interes vaccinal.
Activitate 1.1.3 – Studiu in silico pentru identificarea potențialilor epitopi
    • Se vor realiza studii de bioinformatică folosind unelte disponibile on-line și/sau modelare moleculară de tip „docking” ligand-receptor pentru identificarea epitopilor liniare și/sau conformaționali.
Obiectiv 1.2 – Design variante structuri în vederea asamblării în particule nanometrice
Activitate 1.2.1 – Evaluarea efectului nanostructurilor asupra potențialului imunogen
    • Se va realiza un studiu care va trece în revistă literatura științifică disponibilă cu privire la impactul ansamblurilor macromoleculare nanostructurate în contextul desfășurării unui răspuns imun.
Activitate 1.2.2 – Identificarea celor mai potrivite metode de asamblare a proteinelor în nanostructuri
    • Se vor identifica variantele de inducere a formării ansamblurilor nanostructurate formate din proteine. În cadrul acestei activități se vor avea în vedere introducerea de „tag”-uri sau mutații la nivelul secvenței nucleotidice a proteinelor de interes care, fie vor declanșa autoasamblare, fie vor permite atașarea pe suporturi particulate.
Activitate 1.2.3 – Modelarea in silico a secvențelor ADN pentru facilitarea nanostructurării
    • Se va face design-ul in silico al secvențelor ADN. În această fază se va ține seama de optimizarea codonilor, folosirea secvențelor linker, inserarea de situsuri pentru enzime de restricție, realizarea de proteine de fuziune și cuplarea cu secvențe care să promoveze nanostructurare. Se vor stabili primeri de secvențiere sau primeri pentru mutageneză.
Obiectiv 1.3 – Sinteza secvențelor ADN codificatoare pentru antigenele de interes
Activitate 1.3.1 – Realizarea secvențelor ADN codificatoare pentru proteinele selectate prin tehnici de inginerie genetică
    • Se vor realiza modele teoretice dezvoltate în Activitatea 1.2.3. Se vor folosi tehnici clasice de inginerie genetică, cum ar fi PCR și, după caz, variațiuni de tipul Heterostagger-PCR, Overlap-Extension PCR.
Activitate 1.3.2 – Selecția vectorilor plasmidiali
    • Se vor alege cei mai potriviți vectori plasmidiali ținând cont de sistemul de expresie, procariot sau eucariot. Se va lua în considerare și modalitatea de expresie de proteină, tipul de promoteri folosiți, genele de rezistență etc.
Activitate 1.3.3 – Asamblarea constructelor vector – secvență codificatoare pentru ambele tipuri de expresie
    • Această activitate va reuni rezultatele celor două activități anterioare și va consta în prepararea constructelor de tip vector – secvență codificatoare. Se va folosi clonare prin restricție cu enzime de restricție, clonare TA sau cloanare fără ligare. Constructele obținute vor alcătui o librărie care va sta la baza activităților din următoarea fază.
Faza 2 (2024) – Obținerea de antigene proteice purificate și analiza fizică și funcțională a acestora
Obiectiv 2.1 – Optimizarea expresiei proteinelor de interes
Activitate 2.1.1 – Identificarea celor mai potrivite sisteme de expresie procariotă și eucariotă
    • Se va realiza un studiu cu privire la cele mai potrivite tulpini E. coli pentru expresie procariotă și cele mai potrivite linii celulare mamaliene/de insecte pentru expresie în sistem eucariot. Se vor testa variantele selectate și se vor evalua în funcție de număr de copii de plasmid, rată de expresie proteină, cantitate și solubilitate a proteinei.
Activitate 2.1.2 – Optimizarea condiții de cultură în sistemele de expresie alese
    • Vor fi testate mai multe tipuri de medii de cultură pentru sistemele de expresie de proteină. De asemenea, se va observa influența temperaturii, a nivelului de oxigenare, a pH-ului, a vasului de cultură asupra curbei de creștere a celulelor și asupra cantității și calității de proteină produsă.
Activitate 2.1.3 – Dezvoltare metodologie de optimizare a parametrilor de cultură prin tehnologii de transcriptomică
    • Această activitate are ca scop corelarea parametrilor de cultură cu markeri transcriptomici pentru ca, ulterior, acești parametri să poată suporta modificări luate în baza unor decizii informate, cu obținerea unui randament crescut. Se are în vedere, în principal, dezvoltarea metodologiei de secvențiere de nouă generație în studiul transcriptomicii.
Obiectiv 2.2 – Obținerea proteinelor de interes
Activitate 2.2.1 – Expresie de proteine de interes în condiții optimizate
    • Se vor folosi parametrii de cultură descriși în activitățile anterioare pentru expresia de proteine de interes. Întrucât fiecare specie proteică are nevoi particulare pentru sinteza de succes în sisteme de expresie, se va realiza o revizie a parametrilor de cultură pentru fiecare variantă de proteină și se vor alege cele mai avantajoase condiții. În final se obțin extracte brute conținând proteine de interes.
Activitate 2.2.2 – Procesarea proteinelor exprimate în scopul purificării și refoldării
    • În funcție de particularități, pentru fiecare dintre proteinele exprimate se va aborda o strategie de extracție, purificare și, după caz, refoldare. Pentru extracție se va folosi liză prin ultrasunete, tratament cu presiuni ridicate, șoc osmotic sau tratament cu lizozim (pentru sisteme bazate pe  E. coli). Ulterior extractul brut va putea fi purificat prin mijloace cromatografice de afinitate, de schimb ionic, de excluziune sterică sau interacție hidrofobă. În cazul în care proteinele exprimate și purificate au o structură terțiară necorespunzătoare, se va încerca refoldarea prin tehnici variate. Tot în cadrul acestei activități se va efectua depirogenarea și sterilizarea soluțiilor proteice, cât și stocarea corespunzătoare a acestora.
Obiectiv 2.3 – Caracterizarea fizico-chimică și funcțională a proteinelor de interes obținute
Activitatea 2.3.1 – Identificarea caracteristicilor fizico-chimice ale proteinelor obținute
    • Proteinele obținute vor fi analizate din punct de vedere fizico-chimic pentru a avea o vedere de ansamblu asupra structurii acestora. Se vor folosi calorimetria cu scanare diferențială (DSC) pentru evaluarea stabilității, fluorimetria cu scanare diferențială (DSF) pentru evaluarea stabilității și a plierii corecte, electroforeza în gel de poliacrilamidă (PAGE), împrăștierea dinamică a luminii în variantele DLS și MALS pentru măsurarea dimensiunii, specrometrie de masă MALDI pentru evaluarea integrității secvenței și cuplare a acesteia cu „protein painting” pentru estimarea suprafeței accesibile la solvent etc.
Activitatea 2.3.2 – Evaluarea unor parametri de activitate biologică a proteinelor obținute
    • Dacă se consideră că numai o structură biologică discretă poate îndeplini o anumită funcție, apare necesitatea ca proteinele obținute să fie testate pentru activitate biologică pentru validare structurală. Se vor folosi anticorpi pentru epitopi conformaționali pentru a testa structura terțiară sau cuaternară a proteielor și, acolo unde este posibil, se va testa interacția cu receptorul sau ligandul proteinei. 
Faza 3 (2025) – Formularea de sisteme proteice nanoparticulate pentru livrarea și prezentarea eficientă către celulele ale sistemului imun
Obiectiv 3.1 – Formularea de nanostructuri proteice
Activitatea 3.1.1 – Evaluarea metodelor de livrare și prezentare antigen potrivite pentru dezvoltare de vaccin
    • Se vor analiza variantele de livrare și prezentare de antigen ce pot fi facilitate de nanostructurare și ce avantaje pot să aducă în contextul dezvoltării de vaccin. Se vor inventaria și planifica variantele de nanostructurare prin autoasamblare, dar și prin cuplare cu adjuvanți de tip „carrier”.
Activitate 3.1.2 – Formulare și caracterizare sisteme autoasamblabile
    • Vor fi obținute variante de proteine care se autoasamblează în particule de dimensiuni în domeniul nano. Se va analiza și testa cuplarea mai multor proteine cu același „motiv” structural de asamblare pentru a genera „hetero”-particule care să poată fi folosite la preparate vaccinale multivalente. Se va pune accent pe analiza structurală a particulelor rezultate: se va urmări dimensiunea și separarea lor prin fracționarea fluxului de câmp (FFF) cuplat cu MALS, se va urmări stabilitatea acestora prin DSC și DLS, se va estima numărul de monomeri/particulă.
Activitate 3.1.3 – Formulare și caracterizare sisteme cu adjuvant de tip „carrier”
    • Spre deosebire de sistemele autoasamblabile, în varianta de sisteme cu adjuvant de tip „carrier” se va realiza sinteza/modificarea chimică a adjuvanților folosiți. Deși inovarea se va realiza în jurul sistemelor de tip „oil-in-water”, se va testa și varianta folosirii adjuvanților tradiționali (ex. hidroxid de aluminiu). În ce privește caracterizarea acestor adjuvanți și a complexelor cu proteinele sintetizate, se vor aplica aceleași metode ca pentru variantele autoasamblabile.
Obiectiv 3.2 – Identificarea celor mai performante sisteme proteice nanoparticulate pentru selecția candidaților vaccinali
Activitate 3.2.1 – Dezvoltare modele in vitro pentru măsurarea efectului formulărilor obținute
    • Se vor dezvolta modele de cocultură celule dendritice (DC) - limfocite T naive. DC vor fi diferențiate pornind de la precursori din măduva osoasă cultivați în prezența GM-CSF și IL-4. Limfocitele T vor fi purificate prin selecție negativă, folosind bile magnetice, din splenocite provenind de la soareci naivi.
Activitate 3.2.2 – Dezvoltare metodologie qPCR și/sau secvențiere de nouă generație pentru măsurarea efectului formulărilor obținute
    • Se vor dezvolta metode bazate pe qPCR de detecție a expresiei factorilor transcripționali care controlează diferențierea limfocitelor T în subseturile Th1 sau Th2 (T-bet si GATA3). De asemenea, se vor dezvolta metode bazate pe secvențiere de nouă generație pentru evaluarea mofidicărilor induse de către sistemele nanoparticulate la nivel de transcriptom și epigenom.
Activitate 3.2.3 – Evaluarea in vitro al potențialului imun al sistemelor proteice nanoparticulate
    • Maturarea DC va fi monitorizată prin determinarea expresiei de suprafață a markerilor asociați cu maturarea DC și a moleculelor costimulatoare  (CD80, CD83, CD86, MHC II etc)  prin citometrie în flux și analiza producerii de citokine/chemokine cu rol important în polarizarea răspunsului imun  (IL-12, TNF-α, IL-6, IL-10, CCL2, CCL3, CCL4 etc) folosind tehnologia Multiplex. Candidații vaccinali care vor induce activarea limfocitelor T vor fi utilizați mai departe pentru imunizarea animalelor de laborator.

Faza 4 (2026) – Evaluarea in vivo a răspunsului imun pentru preparatelor nanoparticulate selectate/Concluzie
Obiectiv 4.1 – Testarea candidaților vaccinali pe model experimental de animal de laborator
Activitatea 4.1.1 – Realizarea schemei de imunizare și/sau infecție experimentală și obținerea avizului de etică pentru studiu pe animal de laborator
    • În funcție de numărul de preparate de interes vaccinal care vor ajunge în această etapă se va realiza schema studiului de imunizare și, opțional, infecție experimentală. Se va avea în vedere folosirea unui număr cât mai mic de animale pentru a atinge scopurile propuse. În prealabil se va obține avizul de etică pentru derularea studiului.
Activitatea 4.1.2 – Studiul pe animal de laborator și prelevarea materialului biologic pentru analiză
    • Preparatele vaccinale selectate vor fi administrate animalelor de laborator. Se va colecta ser înainte de inoculări pentru măsurarea dinamicii răspunsului imun. Se vor efectua infecții experimentale prin livrare pe căile respiratorii pentru patogenii virali pentru care facilitatea de studiu de animal poate asigura biosiguranța. La sacrificare, se vor preleva probe de țesut cât mai divers pentru a asigura utilizarea la maxim a animalelor din studiu. De asemenea, se vor realiza teste de citotoxicitate în vitro și de toxicitate pe șobolani. Se vor realiza studii de biodistribuție.
Obiectiv 4.2 – Identificarea parametrilor imunologici în urma studiului pe animal
Activitatea 4.2.1 – Măsurare markeri imunologici relevanți din ser
    • Nivelul de IgG, IgG1 si IgG2a, va fi cuantificat în serul soarecilor imunizati prin tehnica ELISA. Se va testa capacitatea de neutralizare a serurilor prelevate prin microneutralizare.
Activitatea 4.2.2 – Măsurare markeri imunologici relevanți din țesut/celule
    • Populațiile de limfocite T din splină vor fi clasificate prin citometrie în flux. Polarizarea răspunsului imun va fi investigată prin determinarea producerii de citokine intracelulare/secretate (IFN-g, TNF-a, IL-4 , IL-5) de către limfocitele CD4+/CD8+ izolate din splina șoarecilor imunizați , prin citometrie în flux sau utilizând tehnologia Multiplex/ELISPOT. De asemenea, se va investiga inducerea limfocitelor T de memorie prin măsurarea unor markeri de suprafață (cum ar fi CD44, CD62L) și secreție de citokine prin citometrie în flux
Obiectiv 4.3 – Trasarea concluziilor și formularea rezultatelor
Activitatea 4.3.1 – Identificarea celor mai promițători candidați vaccinali dezvoltați
    • Se va realiza o recapitulare a studiului cu scoaterea în evidența a celor mai promițători candidați vaccinali dezvoltați. De asemenea, se vor menționa obstacolele întâlnite, soluțiile găsite și se vor puncta zonele care pot suferi îmbunătățiri.
Activitatea 4.3.2 – Realizarea documentației pentru transfer tehnologic
    • Întrucât soluțiile rezultate din proiect sunt limitate la scală de unitate pilot de dezvoltare și studiu demonstrativ pe animal de laborator, se va concepe o documentație pentru fiecare dintre candidații vaccinali promițători pentru a facilita transferul tehnologic la scală de producție și testare superioară.
Activitatea 4.3.3 – Realizarea unui plan pentru dezvoltarea rapidă a unui candidat vaccinal în context de urgență medicală
    • Realizarea unei platforme de dezvoltare candidați vaccinali va fi considerată un rezultat la fel de valoros ca preparatele propriu-zise dezvoltate în proiect. Analizând retrospectiv desfășurarea proiectului, se vor putea face estimări cu privire la viteza de reacție și probabilitatea de succes în caz de urgență de sănătate publică. Se va redacta un plan/ghid care va constitui punctul de plecare în eventualele situații de urgență la care se pretează soluțiile oferite.
Milestones
M1. Definitivarea colecției de constructe vector – secvență codificatoare corespunzătoare candidaților de nanostructuri proteice (luna 12);
M2. Definitivarea colecției de proteine purificate de interes vaccinal în sisteme de expresie proteine recombinante (luna 24);
M3. Definitivarea colecției de sisteme proteice nanoparticulate capabile să genereze un răspuns imun eficient în testele in vitro (luna 36);
M4. Prezentarea celor mai promițători candidați vaccinali dezvoltați (luna 48).