Institutul Național de Cercetare Dezvoltare Medico-Militară „Cantacuzino”

Diagnosticul de laborator

Diagnosticul se bazează pe lucrarea publicată de Coman și colaboratorii:
https://www.eurosurveillance.org/content/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045 

Centre de testare în România
Bucureşti (Institutul Național de Cercetare-Dezvoltare Medico-Militară „Cantacuzino” și Institutul Național de Boli Infecțioase „Prof. Dr. Matei Balș”, Spitalul Clinic de Boli Infecțioase și Tropicale „Dr. Victor Babeș”), Cluj-Napoca, Iaşi, Timişoara, Constanţa şi Craiova. 
Conform recomandărilor CNSCBT: Testarea se face DOAR la recomandarea medicului, atât în sistemul public, cât și în cel privat de sănătate.
http://cnscbt.ro/index.php/1574-algoritm-testare-internare-externare-23-03-2020/file

Produse patologice ce pot fi testate:

  • Tampon sau spălătură nazofaringiană și orofaringiană la pacienții cu forme clinice medii;

  • Spută și/sau aspirat endotraheal sau lavaj bronhoalveolar la pacienții cu forme clinice severe;

  • Suplimentar: probe de sânge, materii fecale, probe necroptice.

Recomandări privind prelevarea probelor la pacienții simptomatici, precum și la contacții asimptomatici sunt prezentate în Metodologia de supraveghere a sindromului respirator acut cu noul coronavirus al CNSCBT (https://www.cnscbt.ro/index.php/informatii-pentru-personalul-medico-sanitar/1525-metodologia-de-supraveghere-a-covid-19-actualizare-16-03-2020/file)

Toate probele vor fi considerate potențial infecțioase.

Transportul probelor trebuie să respecte ghidurile naționale, precum și recomandările OMS - Guidance on regulations for the transport of infectious substances 2019–2020 (https://www.who.int/ihr/publications/WHO-WHE-CPI-2019.20/en) și

WHO interim guidance for laboratory biosafety related to 2019-nCoV (https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/laboratory-biosafety-novel-coronavirus-version-1-1.pdf).

Metode de testare:

  • Real Time Reverse Transcription PCR (Real Time RT-PCR sau RT-qPCR) - metodă de amplificare a acizilor nucleici, pornind de la genomul viral (codificat sub formă de ARN), având la bază generarea unei matrițe complementare (ADN complementar), amplificarea (multiplicarea) unui fragment țintă specific și detectarea, în cadrul fiecărui ciclu de amplificare, a unui semnal fluorescent specific.

În cadrul INCDMM „Cantacuzino”, kiturile folosite, țintesc atât regiuni specifice pentru Coronavirus în general (test cu valoare de depistare, screening) cât și regiuni pentru detectarea specifică a SARS-CoV-2 (teste de confirmare).

Kit-ul de detectare specifică conține sonde oligonucleotidice (primeri) folosite pentru amplificarea și detectarea SARS-CoV-2, ce țintesc gena nucleocapsidei virale (N). Pentru a putea aprecia calitatea probelor (recoltare, transport, prezență de inhibitori, etc), sunt incluse sonde suplimentare pentru detecția genei RNază P umană (RP) în probele martor și probele clinice.

ARN-ul viral izolat și purificat din produsul patologic (exudat al căilor respiratorii superioare, spută, etc) este transcris la ADN complementar (ADNc) și ulterior amplificat prin reacția de polimerizare în lanț (Polymerase Chain Reaction, PCR). În reacția de PCR, sonda se atașează la secvența țintă specifică. În faza de extindere a ciclului PCR, sonda emite un semnal fluorescent, ce permite detecția ADNc amplificat. Cu fiecare ciclu, se activează molecule suplimentare de fluorocrom, crescând intensitatea fluorescenței. Intensitatea fluorescenței este monitorizată la fiecare ciclu PCR de Sistemul PCR în timp real.

Detectarea ARN-ului viral nu ajută doar la identificarea bolii, ci oferă, de asemenea, informații epidemiologice și de supraveghere utile.

https://www.fda.gov/media/134922/download

O listă a motivelor pentru care un rezultat poate fi fals negativ este detaliat în Metodologia de supraveghere a sindromului respirator acut cu noul coronavirus al CNSCBT.

https://www.cnscbt.ro/index.php/informatii-pentru-personalul-medico-sanitar/1525-metodologia-de-supraveghere-a-covid-19-actualizare-16-03-2020/file

  • O alternativă la reacția PCR, ar putea fi reprezentată de teste rapide ce pun în evidență prezența anticorpilor specifici anti SARS-CoV-2, de tip IgM respectiv IgG în serul pacienților. Aceste kit-uri folosesc 10μL de sânge integral, ser sau plasmă și oferă rezultate în 15 minute. Aceste teste nu au fost incluse, deocamdată, în algoritmul detecție. Întrucât acestea nu detectează componente virale, ci răspunsul imun al individului față de virus, sensibilitatea a fost 88,66%, iar specificitatea este de 90,63%. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32104917

Recomandări pentru personalul medico-sanitar din unitățile sanitare din țară: